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尖锐湿疣的五种诊断好方法

来源:沈阳人流医院 时间:2016-11-08 浏览次数:

  尖锐湿疣是感染人类乳头瘤病毒(HPV)而引起的一种表皮瘤样增生。尖锐湿疣的诊断多依据皮疹特点、发病部位、发展情形联合可能询及的接触史来断定,但少数病人要进行一些帮助实验来确诊。详细实验诊断方法先容如下:

  一、醋酸白试验

  用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟,病灶部位变白稍隆起,肛门病损可能须要15分钟。本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果,HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未沾染上皮细胞发生的不同,只有前者才干被醋酸脱色.醋酸白试验检测HPV的敏感性很高,它比惯例检测察看组织学变更还好。但偶然在上皮增厚或外伤擦破病例中涌现假阳性、假阳性变白迹象显得界限不清和不规则。美国CDC提醒,醋酸白实验并不是特异试验,且假阳性较常见。

  二、免疫组织学检查

  常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法(即PAP),显示湿疣内的病毒蛋白,以证实疣侵害中有病毒抗原。HPV蛋白阳性时,尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应。

  三、组织化学检查

  取少量病损组织制成涂片,用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原,则抗原抗体结合。在过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)方法中,核可被染成红色。此法特异性强且较迅速,对诊断有辅助。

  四、病理检查

  重要为角化不全,棘层高度肥厚,乳头瘤样增生,表皮突增厚,延伸,其增生水平可似假性上皮瘤样。刺细胞和基内情胞并有相称数目的核决裂、颇似AI-G变.但细胞排列规矩,且增生上皮跟真皮之间界线明白。其特色为粒层和刺层上部细胞有显明的空泡构成。此种空泡细胞较畸形大,胞浆着色淡、中心有大而圆,深嗜碱性的核。通常真皮水肿、毛细血管扩大以及四周较致密的慢性炎性浸润。Bushke-loewenstein宏大型尖利湿疣,表皮极度向下成长,取代了其下面的组织、易与鳞状细胞相混,故须屡次活检.若有迟缓发展之偏向,则为一种低度恶变的进程,即所谓疣状AI-G。

  五、基因诊断

  迄今,HPV难于用传统的病毒培育及血清学技巧检测,主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法存在特异、敏感、简便、快捷等长处,为HPV检测开拓了新道路。

  (一)标本的采集及处理

  1.标本的采集和预处理:用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检讨的同时,将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中,用PBS离心(3000g,10min)洗涤2次,沉积细胞重悬于1mlPBS中,取0.5ml细胞悬液抽提。

  2.标本核酸的提取:按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,10mmol/L EDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS,1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下处置过夜;且等体积酚/氯仿(1:1),氯仿/异戊醇(24:1)各抽提2次;加1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2)及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜积淀DNA;加1体积乙醇洗涤1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.0mmol/L EDTA)溶解DNA,37℃温育。

  (二)PCR扩增

  1. 引物设计和合成:HPV基因组可分为早期区(E)和晚期区(L),每区含一系列开放读码框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有守旧序列。Manos等从HPVL1区中抉择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1,该引物与HPV 6、11、16、18及33型有互补序列,也可扩增其它型。

  2.PCR反应试剂:Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP储备液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L),10×PCR缓冲液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5),100μmol/L MY11和MY09贮备液,灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。

  3.PCR扩增方法和程序:以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。

  (1)试验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包含除标本DNA外的其它各种PCR反响试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂。

  (2)各反应管顺次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。

  (3)参加80-100μl石蜡油,在台式离神思上疾速离心数秒钟,使各反应试剂收集于油层下。目前,PCR试剂已商品化,反应体积为25μl。应用时只加入标本DNA即可。

  (4)将反映管置PCR扩增仪上,循环参数为95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 50s轮回35次,最后72℃延长5min。

  4.每次试验应设阳性及阴性对比。以载有HPV的重组质粒(每反应为100pg)或含有HPV的细胞系(如癌ski、HeLa)DNA为阳性对照,以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。

  (三)扩增产物的检测和分析

  1. 凝胶电泳:扩增反应停止后,掏出反应管,冷却至室温,取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪下分析结果,分子量约为450bp处呈现显著的DNA带。

  2. 核酸杂交:假如凝胶电泳无清晰的DNA或需断定DNA带的特异性时,可用标记的公用混合探针和(或)型特异探针作Southern吸印杂交、雀斑杂交验证。

  依照尺度方法制32P ATP标志的寡核苷酸探针,需到达约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h,随后于30-55℃下用洗涤液(2×SSC、0.1%SDS)敏捷冲刷杂交膜,除去过剩探针。然落后行洗膜,其前提依所用探针而异:公用混杂探针,55℃洗膜10min;MY12、MY13及MY16探针,56-57℃下10 min,并换液重洗1次;MY14及WD74探针,58-59℃下10min,亦换液重洗1次。

  用PCR方法检测HPV比核酸杂交办法优胜。其敏理性高,GP-PCR方式以凝胶电泳直接剖析成果,可检出标本中200个拷贝的HPV DNA,若以核酸杂交检测PCR产物,敏感性进步,能检出10个拷贝的HPV DNA。

  鉴于PCR技术的高度敏感性,以生殖道脱落细胞为检材足以满意试验请求,防止了活检取材、研磨组织复杂操作。个别情况下,PCR扩增产物经凝胶电泳,视察产生的DNA可直接作出诊断。因而,PCR技术检测HPV实验周期短、简便倏地。

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